España participa en el primer estudio internacional sobre técnicas diagnósticas de leishmaniasis canina

Leishmania infantum es el agente causal de la leishmaniosis canina (CanL), una enfermedad zoonótica transmitida por vectores potencialmente mortal en el sur de Europa, África, Asia y América. El entorno local afecta la ecología de la enfermedad, pero predominantemente los perros son un reservorio peridoméstico y los flebótomos, el vector biológico. También se produce transmisión vertical o transplacentaria y transmisión a través de transfusión de sangre. La evidencia ha demostrado que los humanos en entornos periurbanos con alta densidad de población también pueden servir como reservorio de L. infantum.

La seropositividad a L. infantum puede variar sustancialmente en áreas endémicas, y no todos los perros infectados desarrollan la enfermedad. También hay un espectro de enfermedad clínica, que puede ser de leve a grave. Estas presentaciones, particularmente asociadas con patología basada en anticuerpos o alta carga parasitaria, comprensiblemente impactan la detección de la infección por L. infantum. Los signos clínicos más frecuentes incluyen lesiones cutáneas (78,4 % de los casos), linfadenomegalia (64,7 % de los casos) y pérdida de peso (47,1 % de los casos). Las anomalías clinicopatológicas incluyen anemia no regenerativa leve a moderada, linfopenia, hiperproteinemia, disproteinemia y proteinuria. Sin embargo, estas anomalías ocurren con frecuencias variables, lo que complica aún más la detección de la enfermedad. La validación de los métodos de diagnóstico serológico en las regiones endémicas ayudará a establecer un diagnóstico consistente y confiable de Leishmania para individuos y una vigilancia en poblaciones.

La seroprevalencia de L. infantum difiere debido a la variación en la densidad de flebótomos, así como a variables ecológicas y ambientales en las áreas endémicas de Europa y la cuenca mediterránea. Los datos serológicos sugieren que, de los 15 millones de perros que se estima que viven en la cuenca mediterránea, aproximadamente el 16,7% (2,5 millones) estaban infectados con L. infantum, y solo el 10 % de ellos presentaron CanL clínica. Se ha demostrado que diferentes etapas de la infección canina tienen diferentes niveles de infecciosidad para los flebótomos. La detección eficaz de la enfermedad leve o moderada podría ser de gran importancia en la prevención y el control de la leishmaniosis canina.

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS DE LEISHMANIASIS CANINA

La detección de anticuerpos contra L. infantum se realiza por múltiples razones: para confirmar la enfermedad clínica, para confirmar la infección (para donantes de sangre, para la cría o antes de la vacunación), para investigar la presencia de infección subclínica, para evaluar intervenciones de salud pública para determinar la prevalencia de CanL como centinela de riesgo para las personas y para evaluar la respuesta inmune a la vacunación en entornos experimentales. Se necesita una evaluación clínica para confirmar o excluir la leishmaniosis clínica como diagnóstico, incluyendo métodos clinicopatológicos de rutina como hemograma completo (CSC), perfil bioquímico sérico y análisis de orina. 

El diagnóstico definitivo de CanL se puede realizar utilizando la observación microscópica de amastigotes de Leishmania en frotis citológicos de órganos y tejidos infectados, específicamente, médula ósea, ganglios linfáticos, piel o sangre periférica, entre otros. Algunos de los métodos utilizados para obtener muestras son demasiado invasivos y generalmente no son ideales para la detección de parásitos en perros sanos infectados. El análisis histopatológico de secciones de órganos infectados teñidos con hematoxilina y eosina también se ha utilizado para detectar parásitos y patrones de lesiones. Este método puede consumir mucho tiempo, y los organismos parásitos son difíciles de identificar y, a veces, no son detectables, lo que resulta en una baja sensibilidad general. Por lo tanto, la inmunohistoquímica de Leishmania con o sin reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR) se emplea en muestras histológicas para aumentar la sensibilidad. 

Por otro lado, la detección de anticuerpos séricos específicos de L. infantum mediante técnicas serológicas cuantitativas, como la prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia (IFAT) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), es esencial para diagnosticar CanL. La IFAT se consideró un "estándar de oro" del diagnóstico serológico; sin embargo, su aplicación requiere un alto nivel de habilidad y experiencia, consume mucho tiempo y requiere equipo de laboratorio especializado. ELISA es ideal para la vigilancia debido a la capacidad de analizar una gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo. Los altos niveles de anticuerpos se han asociado con un mayor nivel de parasitismo y presencia de enfermedad más grave. 

TÉCNICAS SEROLÓGICAS CUANTITATIVAS

En este sentido, se recomienda el uso de técnicas serológicas cuantitativas que brinden un título de punto final (IFAT) o una lectura de densidad óptica sobre ELISA para diagnosticar CanL con precisión. La llegada de vacunas contra L. infantum en Europa ha planteado la posibilidad de detectar la vacunación en lugar de la infección cuando se utilizan pruebas serológicas que no diferencian a los animales infectados de los vacunados (DIVA). Es probable que esto suceda particularmente cuando las vacunas contienen preparaciones completas de antígeno de Leishmania como inmunógenos.

En ausencia de un estándar de oro serológico, se ha utilizado el análisis de clases latentes (LCA) para evaluar las pruebas diagnósticas generando un estándar de referencia estadístico. El estándar de referencia se calcula combinando todos los resultados observados de las pruebas diagnósticas que se evalúan en un gran conjunto de datos.

Se han realizado pocos estudios para evaluar la precisión diagnóstica comparativa de las pruebas de diagnóstico serológicas en Europa, en particular para CanL. A pesar de los esfuerzos de grupos como LeishVet para desarrollar un consenso de recomendaciones para la vigilancia, prevención y control de CanL, no se ha realizado una validación comparativa de las pruebas serológicas de L. infantum. Por lo tanto, utilizando LCA, un estudio realizado por Juliana Sarquis, Laia Solano Gallego, Luis Cardoso, Gaetano Oliva, Gad Baneth, María Grazia Pennisi, Guadalupe Miró y Christine A. Petersen, junto a otros compañeros internacionales, ha planteado comparar el rendimiento diagnóstico de ELISA e IFAT utilizados por siete laboratorios de diagnóstico veterinario afiliados a miembros de LeishVet en áreas endémicas de L. infantum de Europa y la cuenca mediterránea.

33 % DE LAS MUESTRAS POSITIVO EN TODAS LAS PRUEBAS

Los autores realizaron un ensayo para comparar pruebas serológicas cuantitativas de L. infantum. Se eligieron doscientas setenta y dos muestras de suero canino de estado serológico conocido de estos sitios, representativas de la región. Se realizaron ELISA e IFAT internas o comerciales de acuerdo con las especificaciones de cada laboratorio. Se utilizó el análisis de clase latente para determinar la sensibilidad y especificidad de cada prueba. Se calcularon los positivos verdaderos y falsos para determinar la probabilidad de identificar muestras.

De las 272 muestras presentadas, el 33 % de las muestras dieron positivo en todas las pruebas y el 18 % dieron negativo en todas las pruebas. El 49 % de las muestras podrían considerarse “seropositivas” mixtas, es decir, positivas en al menos una prueba, pero no positivas en todas las pruebas. Se compararon los valores de sensibilidad y especificidad por cada tipo de prueba en los siete laboratorios.

La sensibilidad y especificidad de la prueba ELISA oscilaron entre el 95 y el 99 % y entre el 92 y el 97 %, respectivamente, con una variabilidad moderada de un sitio a otro. La sensibilidad y especificidad de la IFAT oscilaron entre el 89 y el 99 % y entre el 83 y el 94 %, respectivamente, con una mayor variabilidad en comparación con la prueba ELISA. La concordancia general de las pruebas fue del 78 %, con una concordancia por pares de entre el 65 y el 89 %.

“UNA PRECISIÓN DIAGNÓSTICA COMPARATIVA SUSTANCIAL”

“Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en evaluar objetivamente las dos técnicas de laboratorio de referencia para el diagnóstico serológico cuantitativo de CanL a nivel internacional en áreas endémicas de varios países”, indican los autores. Sus desempeños son comparables y validados y sus respectivos beneficios medidos. Por lo tanto, “este trabajo puede ser útil para desarrollar futuros trabajos clínicos o epidemiológicos en torno a esta plataforma, proponiendo un diagnóstico serológico preciso o realizando un seguimiento serológico de la infección por L. infantum en perros de un país a otro”.

De este modo, concluyen que “todos los modelos demostraron una precisión diagnóstica comparativa sustancial, con una buena concordancia basada en muestras seropositivas y seronegativas conocidas”. Los estudios y ensayos de intervención que utilizan estas pruebas “seguirán siendo válidos debido a la alta concordancia diagnóstica entre los sitios”.