Veterinarias españolas desarrollan un ensayo para evaluar la inmunidad frente a Leishmania en perros

La leishmaniosis canina (CanL) es una enfermedad zoonótica importante, causada por Leishmania infantum, un protozoo intracelular obligado. Esta infección es frecuente en las regiones de la cuenca mediterránea, Oriente Medio, China y Sudamérica. La transmisión de la enfermedad se produce por la picadura de un flebótomo hembra infectado. Es una preocupación importante porque, solo en la cuenca mediterránea, aproximadamente 2,5 millones de perros están infectados, que se cree que son los principales reservorios. Además, el calentamiento global y las actividades humanas han contribuido a la propagación geográfica y la epidemiología de la infección por L. infantum en Europa, particularmente en España y Portugal.

La manifestación clínica de esta infección es muy amplia. Una alta proporción de perros presentan una infección subclínica crónica, mientras que otros perros manifiestan enfermedad clínica con diferentes grados de gravedad. Existe un amplio espectro de la enfermedad, desde enfermedad clínica leve a muy grave. Por esta razón, se propuso una estadificación clínica, y los perros enfermos se clasifican desde enfermedad leve (estadio I) a enfermedad muy grave (estadio IV).

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA 

Como la respuesta inmune tiene un papel importante en el resultado de la enfermedad, el seguimiento de la inmunidad celular específica de Leishmania del huésped es un determinante para predecir los resultados de la enfermedad. Se utilizan diferentes técnicas para identificar la infección de Leishmania: mediante la medición de citocinas, por ejemplo, o un ensayo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o un ensayo de sangre completa (WBA). Por otro lado, hay pocos ensayos y mal estandarizados para evaluar las respuestas de inmunidad mediadas por células T en perros.

La WBA se utiliza a menudo como una herramienta de diagnóstico para una variedad de enfermedades infecciosas humanas donde la inmunidad mediada por células T juega un papel importante, incluyendo la infección por Leishmania spp. Es el método más adecuado para medir citocinas, ya que contienen todas las poblaciones celulares y factores solubles necesarios para la activación de las células T, y por lo tanto muestra la mejor imitación de las condiciones ex vivo en comparación con PBMC, donde las muestras normalmente no están desprovistas de varios factores de crecimiento y otros componentes inmunes. Además, PBMC requiere más volumen de sangre y requiere mucho tiempo en comparación con la WBA. Por lo tanto, la WBA con antígeno soluble de Leishmania (LSA) seguida de la determinación de citocinas es la técnica más adecuada para proporcionar la detección de pacientes humanos con infección asintomática por Leishmania , y así proporciona una mejor predicción del resultado infeccioso.

Aunque se ha demostrado que el ensayo de sangre completa es una herramienta diagnóstica importante para el monitoreo inmunológico de la leishmaniasis humana, no se usa ampliamente en medicina veterinaria, específicamente en perros. 

En este sentido, algunos investigadores han utilizado la técnica para identificar patrones de citocinas, como IFN-γ e IL-10, en perros con leishmaniosis clínica. 

Así, sucede que la WBA en CanL tiene un largo periodo de incubación y requiere de un esfuerzo e inversión significativos. Por ello, la prueba podría ser difícil de implementar y enfrenta limitaciones en su frecuencia de uso en el ámbito clínico. 

DIFERENTES ESTADOS DE INFECCIÓN

Sin embargo, estudios previos ya han desarrollado y optimizado el ensayo de sangre completa en tubos sin medio, utilizando LSA para detectar la producción de IFN-γ contra la leishmaniasis visceral (LV) en humanos con tiempos de incubación de 20-24 h. Todavía es una técnica bien desarrollada para detectar pacientes humanos infectados asintomáticos con leishmaniasis y medir quimiocinas o citocinas liberadas por linfocitos T específicos de antígeno de Leishmania activados. Aun así, esta forma de realizar WBA no es ampliamente utilizada para el estudio de la infección por Leishmania en perros, ya que solo un estudio utilizó esta técnica, donde el WBA se realizó en tubos sin medio e incubados durante 16-20 h.

En un trabajo reciente, las veterinarias Anna Sára, Andrea Murillo, Clara Jiménez y Laia Solano-Gallego de la Facultad Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona, buscaron identificar un método ex vivo confiable, rápido y factible para evaluar las respuestas inmunitarias celulares caninas al antígeno de L. infantum. Por lo tanto, el objetivo fue investigar un sistema más rápido, práctico y económico de liberación de IFN-γ específico del parásito en tubos (WBA-T) en comparación con un método estandarizado y más largo (WBA-S) en perros en diferentes estados de infección por L. infantum.

El estudio involucró a 41 perros de diferente edad, sexo y raza. Los perros se clasificaron en 4 grupos según su examen físico, historia clínica, niveles de anticuerpos y producción de IFN-γ: (1) sanos seronegativos/no productores de IFN-γ ( n = 14), (2) sanos seronegativos o seropositivos/productores de IFN-γ ( n = 20), (3) enfermos seropositivos/no productores de IFN-γ ( n = 2) y (4) enfermos seropositivos/productores de IFN-γ ( n = 5).

WBA-T se realizó a las 24, 48 y 72 h de incubación. Se establecieron tres condiciones diferentes durante cada tiempo de incubación: sangre con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (control negativo), sangre con antígeno soluble de L. infantum (LSA) a una concentración final de 10 µg/mL y sangre con mitógeno concanavalina A (ConA). La concavalina A, explican los autores, “es una lectina vegetal conocida por su capacidad para estimular la actividad mitogénica de los linfocitos T y exhibir diversas bioactividades. En consecuencia, el tratamiento con ConA conduce a una mayor secreción de citocinas inflamatorias, incluido el IFN-γ, en muestras de sangre”.

WBA-S se realizó en placas, con sangre diluida e incubada durante cinco días usando las mismas condiciones. Los sobrenadantes (WBA-S) o plasma (WBA-T) se recolectaron para la medición de IFN-γ por ELISA. 

EFICIENCIA, RENTABILIDAD E IMPLEMENTACIÓN SENCILLA 

No se observaron diferencias significativas en términos de concentración de IFN-γ entre WBA-T y WBA-S bajo condiciones LSA. Sin embargo, el período de incubación de 48 h durante WBA-T mostró la mediana más alta de concentración de IFN-γ en comparación con otros períodos de incubación y WBA-S. Las concentraciones de IFN-γ bajo estimulación con ConA en WBA-S fueron significativamente más altas que en WBA-T en todos los tiempos de incubación estudiados. 

Ante estos resultados, comentan que “el uso de WBA-T no solo nos permite obtener resultados de IFN-γ de perros con tiempos de incubación más cortos, sino que también ofrece la ventaja de una técnica sencilla que requiere un cuidado mínimo”. Esto hace que “el método sea adecuado para su uso en entornos de laboratorio básicos, lo que potencialmente permite una adopción más amplia de la medición de citocinas en perros”. 

Como resultado, este enfoque, celebran, podría mejorar significativamente el seguimiento de las respuestas de las células T en perros infectados con L. infantum, lo que contribuiría a una mejor comprensión de la infección y respaldaría el desarrollo de nuevos tratamientos o vacunas.

En conclusión, el período de incubación de 48 h de WBA-T surgió como la duración óptima dentro de la condición WBA-T después de la estimulación con LSA. En consecuencia, “un protocolo WBA-T de 48 h puede considerarse apropiado para evaluar la producción de IFN-γ en un entorno clínico debido a sus atributos favorables, que incluyen eficiencia, rentabilidad e implementación sencilla”.