Desarrollan una nueva prueba para la detección económica de distintos genotipos de la peste porcina clásica

La peste porcina clásica (CSF), una de las enfermedades más importantes de la sanidad animal, sigue siendo un reto para el control de la enfermedad. Está causada por el virus de la PPC (VPPC), un virus ssRNA (+), miembro del género Pestivirus. Las estrategias de control contra la PPC dependen de un diagnóstico rápido, principalmente pruebas ELISA para anticuerpos anti-CSFV, así como de la detección molecular del ARN viral mediante RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) (OMSA, 2019). Aunque han demostrado ser muy útiles, estas técnicas requieren el uso de equipos especializados que no están fácilmente disponibles en las proximidades de las granjas o mataderos donde se realizan las pruebas. Además, el equipo especializado, y el personal altamente cualificado, para llevar a cabo las pruebas RT-qPCR tampoco está fácilmente disponible en muchos países en desarrollo. Esto aumenta considerablemente el tiempo necesario para obtener un resultado, lo que a su vez aumenta el tiempo para tomar medidas para controlar la infección en los rebaños afectados.

La PCR de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) plantea una de las alternativas más interesantes, debido a sus métodos de detección. La LAMP-PCR puede realizarse mediante detección fluorométrica, con la ayuda de equipos fácilmente transportables, o incluso mediante detección colorimétrica, observable a simple vista. El objetivo de un estudio realizado por Adriana Muñoz Aguilera, Liani Coronado, Rosa Rosell, y Mònica Alberch del IRTA-CreSA (Centro de Investigación Sanidad Animal); y Jose Alejandro Bohórquez, Saraswathi Lanka y Carol W. Maddox de la Universidad de Illinois, fue diseñar y validar un nuevo ensayo LAMP para la detección rápida, sensible, específica y económica del ARN del VPPC en formatos fluorométrico y colorimétrico para ser validado junto con el ensayo RT-qPCR de referencia del VPPC.

TÉCNICA DE PCR DE AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR BUCLE

Se desarrolló una técnica de PCR de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), con cebadores diseñados teniendo en cuenta todos los genotipos del virus de la peste porcina clásica notificados. La reacción se ensayó mediante detección fluorométrica y colorimétrica, en comparación con la técnica de referencia. Se analizaron cepas virales de tres genotipos circulantes del virus de la peste porcina clásica, así como muestras de animales infectados. También se ensayaron otros patógenos, para determinar la especificidad de la PCR LAMP. Además de los métodos de extracción de ARN en laboratorio, se evaluó un método de calentamiento para la liberación de ARN, fácilmente adaptable a las condiciones de campo.

Se generaron tres conjuntos de cebadores, uno de los cuales mostró un mejor rendimiento. Este conjunto de cebadores demostró ser capaz de mantener un rendimiento óptimo a diversas temperaturas de amplificación (60°C – 68°C). Se analizaron cepas virales de tres genotipos circulantes del virus de la peste porcina clásica, así como muestras de animales infectados. También se ensayaron otros patógenos, para determinar la especificidad de la PCR LAMP. Además de los métodos de extracción de ARN en laboratorio, se evaluó un método de calentamiento para la liberación de ARN, fácilmente adaptable a las condiciones de campo.

Vale la pena destacar que el ensayo LAMP, ya sea por detección fluorométrica o colorimétrica, mostró una sensibilidad similar a la del ensayo RT-qPCR del CSFV reportado por Hoffmann et al., 2005, al evaluar muestras de ARN extraídas magnéticamente del genotipo 1. Por el contrario, el uso de esta prueba CSFV-LAMP sobre el terreno utilizando un equipo mínimo, en particular mediante detección colorimétrica, “puede verse limitado al intentar analizar muestras de suero, ya que todas ellas resultaron negativas al evaluar muestras de suero hervidas”, indican los autores.

Esto puede deberse a las capacidades tampón del suero, que dificultan la variación del pH de la mezcla maestra y, por tanto, el cambio colorimétrico. En un estudio anterior se informó de problemas similares en ensayos LAMP colorimétricos. Por lo general, “este fenómeno puede resolverse mediante la dilución del suero, como ocurrió con las muestras de animales infectados con la cepa Catalonia del genotipo 2 del virus de la peste porcina clásica”. No obstante, esta posible limitación puede superarse mediante el uso de otras muestras mínimamente invasivas, como hisopos nasales y rectales, que no mostraron estos problemas y pueden recogerse de forma menos invasiva e incluso con menos entrenamiento en el entorno de una granja, indican.

Además, los resultados obtenidos utilizando muestras de cerdos infectados experimentalmente con la cepa del genotipo 2 del virus de la peste porcina clásica evidenciaron un mejor rendimiento del método de detección colorimétrico que del fluorométrico. La reacción LAMP colorimétrica “coincidió con el 93,3 % de los resultados de la RT-qPCR y fue capaz de detectar ARN viral en todas las muestras, independientemente del método de extracción, tras 14 días de infección”. Esto lo consideran particularmente alentador, teniendo en cuenta que la carga de ARN viral en algunos de los hisopos nasales y rectales a los 7 dpi estaba cerca del límite de detección de la RT-qPCR

UNA ALTERNATIVA ÚTIL PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DEL VPPC

Un posible inconveniente de la prueba CSFV-LAMP reside en la detección inespecífica del nuevo ARN viral del OVPV. Este resultado “no es del todo sorprendente”, dada la estrecha proximidad genómica del OVPV con el CSFV, así como el hecho de que el ARN de este virus puede detectarse mediante la RT-qPCR del CSFV descrita anteriormente por Hoffman et al., 2005. Sin embargo, con los resultados obtenidos con el formato colorimétrico, “sólo es posible detectar el OVPV en un resultado dudoso si circula una gran cantidad de carga viral”.

Así, los autores destacan la rápida capacidad de este virus para generar anticuerpos tras la infección, lo que en cualquier caso favorecería la reducción de la carga viral circulante y, por tanto, la reactividad cruzada del OVPV con la prueba aquí desarrollada. Además, sugieren que es poco probable que la reacción cruzada del ensayo LAMP con OVPV se traslade a un contexto de campo, ya que “el único estudio relativo a la infección experimental de cerdos con OVPV mostró que la carga de ARN viral detectada en cerdos tras la infección es muy inferior a la utilizada para la prueba del ensayo LAMP en el presente estudio”.

En resumen, los resultados del presente estudio “muestran el desarrollo de una herramienta novedosa para la detección del virus de la peste porcina clásica, que puede tener importantes aplicaciones en un entorno de campo, donde siguen persistiendo formas subclínicas y crónicas de la enfermedad”. Algunas de estas formas de la enfermedad “no pueden diagnosticarse mediante las técnicas serológicas utilizadas habitualmente en los programas de vigilancia, y su detección depende de la amplificación del ácido nucleico”. El uso conjunto de técnicas de diagnóstico novedosas y tradicionales podría resultar “una alternativa útil para la detección precoz del VPPC, lo que se prestaría a una actuación más rápida y tendría un impacto global positivo en la erradicación de la enfermedad”. Por lo tanto, los autores comentan que es necesario establecer normas y directrices oficiales para el uso de pruebas de diagnóstico en el punto de atención en los programas de vigilancia y control de enfermedades de declaración obligatoria para la OMSA.