MAPA no confirma presencia de SARS-CoV-2 en visones silvestres capturados en España

El día 23 de marzo de 2021, la autoridad veterinaria competente para sanidad animal de la comunidad autónoma valenciana, recibió información de su homólogo del Servicio de Vida Silvestre, comunicándole la aparición de un resultado de RT-PCR positivo a SARS-CoV-2 en muestras de ganglios mesentéricos de dos visones silvestres americanos capturados en las cuencas de los ríos Palancia y Mijares en la provincia de Castellón los días 14 y 28 de enero de 2021. Los animales fueron capturados vivos sin que mostraran ningún tipo de síntoma clínico. Tras su sacrificio, durante la necropsia de los cadáveres no se detectaron lesiones compatibles con la infección por SARS-CoV-2 en los mismos.

El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA) explica que los análisis habían sido realizados en el Laboratorio de la Universidad Cardenal Herrera-CEU (UCHCEU), dentro de un proyecto de investigación, obteniendo “un resultado positivo a SARS-CoV-2 mediante una RT-PCR diseñada por el propio laboratorio en muestras de visones americanos silvestres no consideradas de elección para diagnóstico de este virus (ganglios mesentéricos)”.

Estas mismas muestras resultaron previamente negativas a SARS-CoV-2 empleando un kit de PCR comercial.

ANÁLISIS REALIZADOS POR LOS LABORATORIOS

Las necropsias y la obtención de muestras se realizaron el 28 de enero y se mantuvieron congeladas a -80°C hasta que se comenzó el análisis el 8 de febrero. El laboratorio homogeneizó el órgano completo en un volumen de 200 µl de solución inactivante de virus y utilizó la totalidad del homogeneizado preparado para la extracción de ARN total, empleando un kit comercial (NZY Total RNA Isolation kit, NZYtech, Portugal). A partir del ARN extraído, realizaron secuencialmente dos tipos de análisis dirigidos a la detección de genoma viral de SARS-CoV-2:

-Análisis RT-PCR en tiempo real, empleando Viasure RT-qPCR kit (CerTest Biotec, España), un kit que cuenta con la autorización por vía de urgencia de la FDA para el diagnóstico de SARS-CoV-2, que emplea primers/sonda dirigidos a los genes virales ORF1ab y N, así como al gen Rnasa P que sirve como control interno, con resultado negativo en las 13 muestras de visones analizadas.

-Preparación de un ADN complementario con NZY First-Strand cDNA Synthesis Kit (NZYtech, Portugal) que fue posteriormente empleado en una reacción de qPCR empleando el kit NZYSSpeedy qPCR Green Master Mix, con primers dirigidos al gen viral de la glicoproteína S del SARS-CoV-2, diseñados por los científicos de la UCHCEU, autores del informe. En este segundo análisis, las muestras de dos visones resultaron positivas, aunque con valores de Ct muy elevados (30,04 y 35,09) y confirmaron, tanto por su tamaño en electroforesis en gel de agarosa, como posteriormente por secuenciación del amplicón, que no se trataba de una inespecificidad, puesto que la secuencia coincidía con la de SARS-CoV-2.

El mismo día 23 de marzo, la autoridad competente en sanidad animal de la comunidad valenciana realizó una toma de muestras por duplicado de hisopos orofaríngeos (muestra indicada para el diagnóstico de SARS-CoV-2) de los cadáveres de los dos visones informados con resultado positivo, para llevar a cabo un análisis de SARS-CoV-2 en la Unidad de Análisis de Sanidad Animal (UASA), laboratorio oficial de Sanidad Animal de la Comunidad Valenciana. En este laboratorio se llevó a cabo el análisis empleando la técnica recomendada y transferida por el Laboratorio Central de Veterinaria (LCV), que actúa a petición del MAPA como Laboratorio de Referencia para SARS-CoV-2 en muestras de animales, que consiste en una RT-PCR en tiempo real dirigida al gen viral E (altamente conservado) y posteriormente la confirmación en muestras positivas mediante otra RT-PCR dirigida al gen N (CDC, 2020). El resultado del análisis llevado a cabo en UASA fue negativo en las muestras duplicadas de hisopos orofaríngeos obtenidos de ambos animales.

Ante la discrepancia de los resultados y puesto que los resultados de ambos laboratorios no habían sido obtenidos en el mismo tipo de muestra, solicitaron muestra a la UCHCEU, por parte de la autoridad competente de la Comunidad Valenciana, pero no fue posible obtenerla ya que la habían agotado por completo durante sus análisis.

Por ello, decidieron realizar una nueva toma de muestras a partir de los dos animales sospechosos que habían sufrido tres procesos de congelación/descongelación, tanto muestras consideradas de elección para la detección de SARS-CoV-2, como de los mismos tejidos a partir de los cuales se obtuvo resultado positivo en el UCHCEU, y analizadas en dos laboratorios de diagnóstico oficial en España (UASA y LCV), resultando negativas por RT-PCR a SARS-CoV-2, empleando técnicas acreditadas.

En definitiva, concluyen en su informe que "no se ha podido confirmar la presencia del SARS-CoV-2 en ninguna muestra de los visones silvestres analizados en España".